山东出入境检验检疫局　高宏伟  刘心同  陈世山  丁士兵  昃向君　中国计量科学研究院  施昌彦

　　一、目标

　　按ISO21570(Foodstuffs-Detection of genetically modified organisms and derived products-Quantitative nucleic acid based methods)测定大豆样品中转基因大豆含量定量检测的不确定度。
　　本课题是对动植物检验检疫领域定量检测项目进行不确定度评定的尝试。    

　　二、测量程序

　　1.DNA提取
　　大豆DNA的提取，按照国际标准草稿ISO/DIS 21571(Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Nucleic acid extraction)进行。

　　2.定量检测
　　(1)阳性参照标准品的设立(可任选其一)。
　　(2)将转基因大豆标准物质(%)的DNA，调整至相同浓度(ng/μL)，作为定量反应的模板。
　　(3)对含有待检外源基因和内源基因的阳性质粒DNA，将其浓度调整为相同体积含有不同DNA拷贝数(如:0、10、100、1000、10000拷贝/5μL或0.01、0.1、1、10、100pg/μL的DNA)，作为定量反应的模板。
　　(4)实时荧光PCR反应体系。
　　实时荧光PCR反应体系见表1，引物序列按ISO21570的规定。
    

　　(5)实时荧光PCR反应参数。
　　实时荧光PCR的反应参数为:50℃/2min；预变性95℃/3min；95℃/15s，60℃/1min，40个循环。

　　(6)上机运行。
　　按预先设定的样品摆放顺序，依次摆放PCR反应管，在样品名输入处编辑实时荧光PCR反应参数并开始运行仪器。运行结束后分析并保存数据。

　　(7)基线的设置和数据记录。
　　反应结束并分析结果后，应设置无效基线范围。无论采用哪条荧光通道(FAM或TET)，基线范围选择在3～15个循环，阈值设置原则上以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且以Ct值等于40为准。

　　(8)使用质粒作为定量检测参照物的结果计算。
　　①绘制标准曲线和推导回归方程
　　根据标准物质中含有的作物内源基因和外源基因的量，以及所得Ct值之间的对应关系，分别以Ct值为纵坐标，以内源基因或外源基因量的对数为横坐标，拟合标准曲线并可分别得到内源基因或外源基因的线性回归方程。
    
　　式中:A——样品中内源基因或外源基因的量；Ct——样品的Ct值；k——标准曲线在y轴的截距；m——标准曲线的斜率。
　　②待测样品中转基因成分含量的计算
　　将所测得的待测样品外源基因或内源基因的Ct值代入各自的回归方程，计算出样品中内源基因或外源基因的拷贝数。根据公式(1)计算样品中转基因成分的百分含量。
    
    式中:C——样品中转基因成分的百分含量，%；A_外——样品中外源基因的量；A_内——样品中内源基因量。    

　　三、检测结果(如图1所示)

    图1  检测结果

　　对1个含转基因大豆的大豆样品做7次平行测定，结果见表2。
    

　　四、数学模型

　　
　　式中:C——样品中转基因成分的百分含量，%；Ct——样品中外源基因或内源基因的Ct值；k——标准品中外源基因或内源基因的标准曲线在y轴上的截距；m——标准品中外源基因或内源基因的标准曲线的斜率。    

　　五、不确定度来源(如图2所示)    

    图2  样品测量不确定度来源因果图

　　六、标准不确定度评定

　　1.A类标准不确定度评定
　　A类不确定度由各类随机效应引起，计算如下:
　　
    

　　2.B类标准不确定度评定
　　(1)标准曲线读数Ct值的标准不确定度
　　标准系列样品的测量值和计算数据如表3和表4所示，用最小二乘法计算曲线方程。
    

    在样品实际检测中，标准曲线只做1个重复，在测量点A_外=0.031和A_内=0.845处，Ct_外=30.340和Ct_内=25.040(平均值)，由标准曲线引入的标准不确定度分量计算如下:
    在试样的测量次数p=1时，最小二乘法引入的不确定度分量为:
    
    式中:s(1gA)——由标准溶液Ct值残差计算的标准差；n——标准溶液的测定次数；lgA₀——实测点浓度的对数。
    
    故其相对标准不确定度为:
    
    内源基因标准曲线的不确定度u(Ct内)分量为:
    
    故其相对标准不确定度为:
    
    标准曲线的不确定度是用统计原理计算得到的，其自由度为n-2。所以:
    

　　(2)移液枪的标准不确定度
    移液枪造成的不确定度呈均匀分布。
    移液枪在其测量范围(10～100)μL(V₀)内的最大允差为±0.1μL，由此带来的标准不确定度(μL)。使用的加样体积为12.5μL，故其相对标准不确定度为u_rel1=0.0577/12.5=0.0046。
    移液枪在其测量范围(0.5～10)μL(V₁)内的最大允差为±0.02μL，由此带来的标准不确定度u₂=0.02/=0.0115(μL)。使用的加样体积分别为2μL、2μL、8.2μL，故其相对标准不确定度分别为u_rel2=0.0115/2=0.0057、u_rel3=0.0115/2=0.0057、u_rel4=0.0115/8.2=0.0014。
    移液枪在其测量范围(0.1～2.5)μL(V₁)内的最大允差为±0.002μL，由此带来的标准不确定度u₃=0.002/=0.0011(μL)。使用的加样体积为0.3μL，故其相对标准不确定度为u_rel5=0.0011/0.3=0.0036。
    考虑到各范围测量的独立性，移液枪允差带来的合成相对不确定度为:
    
    标准不确定度以最大偏差估计，其自由度可取为无穷大，即ν₃=ν₄=ν₅=∞。

　　(3)B类标准不确定度的合成
    B类不确定度各分量u_rel外，u_rel内，u_rel枪相互独立，所以其灵敏系数均为1，u_rel外，u_rel内，u_rel枪合成为B类合成标准不确定度u_ref:
    

　　3.合成标准不确定度评定
　　考虑到A类标准不确定度和B类标准不确定度相互独立，则
    
    

　　七、扩展不确定度评定和报告

　　U=k×u_c，包含因子k为置信水准p=95%、自由度ν=6的t分布临界值，按非整ν内插计k=2.45，故U=2.45×0.5201%=1.3%。
　　测量结果C%=3.73%±1.3%，其中1.27%是扩展不确定度U，它取决于合成标准不确定度u_c=0.5201%和包含因子k=2.45，k的值基于置信水准p=95%、自由度ν=6的t分布。

　　致谢:本文得到了国家质量监督检验检疫总局课题《食品安全实验室质量管理、技术运作和评审认可体系的研究》(2003IK037)的资助。