上图显示了一个间距为5000 nm±1nm的孔径阵列。孔使光穿过载玻片上的金属膜。利用光学显微镜对孔径阵列成像会导致孔径间距出现明显误差。了解真实间距可以校正这些成像误差。这个校准过程可以准确测量大图像上的位置。Credit: NIST

在过去的二十年里，科学家们已经发现光学显微镜可以用来探测、跟踪和成像比传统极限小得多的物体——大约是可见光波长的一半，或者几百纳米。

这项具有开创性的研究获得了2014年诺贝尔化学奖，它使研究人员能够追踪受精卵中的蛋白质，观察分子如何形成大脑神经细胞之间的电连接，并研究微型发动机的纳米级运动。

现在，美国国家标准与技术研究院（NIST）的研究进展使显微镜能够以更高的准确度测量这些纳米级的细节。

“我们把光学显微镜再放到一个显微镜下，以达到接近原子级的准确度，”NIST的项目负责人Samuel Stavis说。

由于光学显微镜传统上没有被用于纳米范畴的研究，因此，它们通常也不进行纳米级准确度所必需的校准，即与标准进行比较以检验结果是否准确。显微镜可能是精确的，可以始终如一地指示出单个分子或纳米颗粒的相同位置。然而，与此同时，它也可能是极其不准确的——由于无法解释的误差，本应能识别十亿分之一米范围内的显微镜对物体位置的识别实际上可能是百万分之一米。NIST这项研究的合著者Jon Geist说：“只有精度而没有准度是非常误导人的。”

为了解决这个问题，NIST开发了一种新的校准方法，可以仔细检查和纠正这些成像错误。这一方法使用的参考物质（具有众所周知的稳定特性的物体）具有大规模生产的潜力，并可广泛分布到各个实验室。

这一点很重要，因为光学显微镜是常见的实验室仪器，可以很容易地放大各类不同的样品，从精细的生物样品到电子和机械设备。此外，随着光学显微镜在智能手机中加入了科学版的照明光和摄像头后，它们的功能变得越来越强大，也越来越经济。

NIST团队依靠纳米级制造工艺来开发这种参考物质。研究人员使用电子束和离子铣削技术，在玻璃载玻片上穿过铂薄膜形成针孔小孔阵列。这一过程使研究小组能够将孔径间隔控制在5000纳米，准确度为1纳米左右。通过这种方式，研究人员在光圈位置上建立了一个准确度测量系统。

穿过孔径阵列发出的光产生了一系列成像点。但是由于所有显微镜镜头都有瑕疵，因此在成像过程中不可避免地会造成误差，这些误差会改变点的视在位置，从而使光圈之间的间距看起来大于或小于团队设计的实际间距。知道真实的间距可以校正成像误差，并可以校准显微镜，从而可以在一个宽泛的视野中高准度地测量位置。

即使是一个小错误也会导致大问题。以显微镜为例，当制造商指定的预期放大倍数为100倍时，显微镜的实际放大倍数为103倍，在显微镜下成像时，就会产生3%的误差。由于透镜的缺陷，一个更微妙的问题也出现了——显微镜的放大率改变了图像，导致图像失真。为了解决这个问题，NIST团队设计了可在大视野范围内工作的孔径阵列和校准过程。

这种孔径阵列可使单个研究人员能够在自己的实验室中进行校准，它将使光学显微镜准确定位单个分子和纳米颗粒位置的能力提高1万倍。

Stavis和他的同事们，包括来自NIST和马里兰大学的马里兰纳米中心的第一作者Craig Copeland，已将其研究成果发表于期刊Light: Science & Applications（《光：科学与应用》）。

“我们确定并解决了一个未被充分认识的问题，”Copeland说道。

在用这种阵列校准了光学显微镜后，研究小组又反过来使用他们的光学显微镜来识别纳米制造过程中的原型阵列缺陷。“为了控制孔径间距，我们测试了纳米制造的极限，”NIST纳米制造的管理人及合著者Rob Ilic说。光学显微镜的简便性和快速性可在生产过程中对孔径阵列的质量进行控制。

最后，研究小组利用孔径阵列的固有稳定性来评估荧光纳米颗粒（通常在光学显微镜中用作固定参考点）到底是固定在一个特定的点上，还是在四处移动。研究人员发现，虽然光学显微镜无意的运动使纳米颗粒的图像变得模糊，但孔径阵列显示纳米颗粒实际上并没有出现原子级移动。