卫生部临床检验中心　汪静  郭健  陈文祥  谢洁红  张传宝  马嵘  赵海舰

本文为“第一届《中国计量》中青年优秀科技论文奖”三等奖获奖文章之一

　　酶学测定是临床检验的常规项目，其测定结果的不确定度评估目前在国内尚未开始。但国内酶学参考实验室网络已略具雏形，其主要功用之一是为酶参考物质赋值，无论是国际还是国内均要求在给出参考物最佳期望值的同时给出该值的不确定度，因此，如何评估酶学参考方法测定结果的不确定度就成为一个亟待解决的问题。我们通过详细分析在本实验室条件下运行国际临床化学联合会(IFCC)丙氨酸氨基转移酶(ALT)参考测定方法的全部过程，参照JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》、JJF1135-2005《化学分析测量不确定度评定》、CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》，对测定结果的不确定度进行试评估，希望能建立一种较为科学合理的酶学参考方法测定结果不确定度的评估模式。    

　　一、材料与方法

　　1.样品
　　冻干人血清，复溶体积5mL，在-20℃下保存。复溶采用称重法，记录两次称重数据及水温，查《1990年国际温标纯水密度表》换算出实际复溶体积。

　　2.试剂
　　乳酸脱氢酶(LDH)购自ROCHE公司，其余试剂购自SIGMA公司。按照IFCC 37℃ ALT参考测定方法中的试剂配方进行试剂配制，所用天平为 级(特种准确度级)，pH计为0.1级(示值误差≤|±0.01|)，容量瓶为A级，温度计准确度为±0.02℃，所有称量步骤的扩展不确定度(k=2)均小于1.5%。

　　3.仪器
　　HITACHI U3000可见紫外分光光度计及配套比色皿温度控制附件，D642高精度温度计，THERMO 520A pH计，METTLER AE163电子天平，EPPENDORF移液器，HAMILTON稀释分配器。

　　4.测定方法
　　测定原理为样品(200μL)中的ALT催化反应试剂(2000μL)中的L-丙氨酸与启动试剂(200μL)中的α-酮戊二酸，使之转化为丙酮酸与L-谷氨酸，新生成的丙酮酸在反应试剂中的LDH的催化下，被NADH还原为乳酸，NADH同时转变为NAD+，由于NADH在340nm处有最大吸收，此时测定340nm下NADH吸光度的下降速率即代表样品中ALT的活性浓度。本次实验在1天内完成，重复测定样品10次，试剂空白测定2次。将测定结果记录后进行统计学分析。    

　　二、测量不确定度评定的结果与讨论

　　1.测定结果中不确定度来源分析
　　样品中ALT活性浓度C由下式确定:
    
    设:，则式(1)变为
    
    式中:C——样品中ALT活性浓度，U/L；B_m——样品反应速率，min^-1；B₀——试剂空白速率，min^-1；ε——NADH在340nm下的摩尔吸光系数，m²mol^-1；V_R1——反应试剂体积，2.00mL；V_R2——启动试剂体积，0.20mL；V_s——样品体积，0.20mL；V_Res——样品复溶体积，mL；L_m——实验比色皿实际光径，mm。
    设，V=V₁+V₂+1，则最终得到测量的数学模型为
    
    式中:ε为常数，其不确定度可忽略。因此，V_Res、L_m、V、B这4个输入量的不确定度是测定结果C的主要不确定度来源。

　　2.评定标准不确定度分量
　　(1)样品复溶体积(V_Res)的标准不确定度u_VRes
    采用称重法确定样品复溶体积，数学模型为
    
    则有:
    
    因皮重mt与毛重mg是由同一台天平测量的，所以二者相关，且相关系数r为-1。由此得到:
    u²_(mg-mt)=u²_mg+u²_mt+2ru_mgu_mt
    u²_mg=u²_mt=u²_天平=u²_偏载+u²_示值+u²_重复
    u²(mg-mt)=(u_mg+u_mt)²=(2u_天平)²
    水温为23.86℃，因本实验室温度计的最大允许误差为±0.02℃，故测温误差对水密度的影响可忽略，水密度ρ的不确定度主要源于密度值本身的扩展不确定度，本文为5×10^-3kg/m³(k=2)。表1列出了复溶体积不确定度评定时的相关数据。

表1  复溶体积不确定度评定时标准不确定度分量评定一览表

　　注:根据JJG1036-2008《电子天平》检定规程中所规定的天平重复性检定方法，天平重复性实验标准差按极差方法计算。本次测得数据的极差为0.05mg，测量6次，所以n=6，查表得d_n值为2.53，计算出由重复性引入的标准不确定为1.98×10^-2mg。
    将数据代入式(3)，可得出样品复溶体积:
    V_Res=4.995mL
    将数据代入式(4)，则有
    

　　(2)实验皿光径修正(L_m)的标准不确定度u_Lm
　　在标准皿与实验皿中分别加入440nm下吸光度约为0.45的重铬酸钾溶液2.00mL，测定440nm处的吸光度，计算得出实验皿的实际光径。计算公式为
    
    式中:L_m——实验皿光径；A_m、A_s——实验皿与标准皿吸光度；L_s——标准皿光径。
    光径修正不确定度主要源于光度计的透射比准确度与标准皿光径值的不确定度。当透射比读数误差为1%时，所引起的测定结果相对误差()约为3%。检定报告中给出的光度计的透射比误差为0.2%，所引起的测定结果相对误差为0.6%。由证书得知，标准皿光径值的扩展不确定度为U=(1+L_S/100)，k=2。表2中列出了光径修正不确定度评定的有关数据。

表2  光径修正不确定度评定的相关数据

　　将表2中的数据代入下式则得到光径修正的标准不确定度为
    

　　(3)反应速率(B)的标准不确定度u_B
　　在180s内每20s读取一次吸光度，所得数据采用最小二乘法，以时间(min)为自变量、吸光度为因变量得出回归方程，斜率b的值即为反应速率值，因此，u_B中包含了b的不确定度。温度T对B的影响也是不能忽略的，通常T每升高10℃，B增加0.5～1.5倍，本例取中间值1.0。由于参考方法要求T的扩展不确定度为0.1℃(k=2)，则相应的反应速率变化为1%。
    B的数学模型为
    
    式中:A——吸光度；t——监测时间；a——回归方程的截距；b——斜率。
    表3中列出斜率b的标准不确定度评估相关数据(以一次测定为例)。

表3  斜率b的标准不确定度评估相关数据

　　两次试剂空白速率的标准不确定度平方分别为(原始数据从略):
    u²_B01=u²_b01+u²T₀₁=2.69×10^-8+1.67×10^-10=2.71×10^-8min^-2
    u²_B02=u²_b02+u²_T02=3.94×10^-8+1.35×10^-10=3.95×10^-8min^-2
    代入式(5)，可得出反应速率的标准不确定度为
    

　　(4)加样体积(V)的标准不确定度u_V
　　由式(2)可知，加样体积V的数学模型为
    V=V₁+V₂+1
    因有:
    故V₁与V₂间是相关的，在进行方差合成时需计算两者的协方差，公式为
    
    实验过程中由EPPENDORF加样枪加注样品0.20mL(V_s)，由HAMILTON稀释分配器1号与2号分别加注反应试剂2.00mL(V_R1)与启动试剂0.20mL(V_R2)。实验室用称重法对加样装置的准确性与精密度进行验证，重复次数n为10，称量均值为，加样重复性实验标准差为SD。则数学模型为
    
    由于已考虑了加样重复性，在天平称量不确定度中可以不考虑天平重复性，因此
    u²_天平=u²_偏载+u²_示值
    表4与表5中列出了加样体积标准不确定度评估的相关数据，部分数据可参考表1。

 表4  加样体积标准不确定度评估相关数据    

 表5  重复测定结果及相应的不确定度评估参数

    由表4中的数据可计算得出:
    

　　3.计算合成标准不确定度
　　由式(2)得出ALT活性浓度C的合成标准不确定度为
    
    将前述各值代入式(6)中，得
    

　　4.计算扩展不确定度
　　取包含因子为2，则本例ALT浓度及其扩展不确定度为
　　C=199.6U/L，U_C=3.2U/L(k=2)

　　5.重复测定结果的不确定度评估
　　对于在重复性条件下进行多次测定的结果，其总体均值的不确定度评估应包括单一结果的不确定度及多次测定的重复性。在进行不确定度评估之前应先进行异常值检验，将异常值剔除后再进行评估。异常值检验可使用Grubbs法或Dixon法。
    总体均值的计算公式为，则有
    
    表5中为重复测定10次的ALT浓度(已进行异常值检验)及相应的不确定度评估参数。
    将数据代入式(7)，得出:
    取包含因子为2，则重复性条件下ALT测定均值及其扩展不确定度为
    

　　三、结论

　　在对ALT活性浓度进行不确定度评估时，如测量数学模型中输入量间是乘积关系，则标准不确定度分量可以采用相对方差合成的方式计算，不需求出灵敏系数；当数学模型不完全是乘积关系时，就不能采用相对标准不确定度合成的方式计算，此时必须计算灵敏系数，才能将输入量的不确定度转化为输出量的不确定度。本例中在被测量C的函数关系式中，原来输入量之间不完全是相乘的关系，经过变换，数学模型中输出量转化为4个输入量的乘积。这样就使最终合成标准不确定度的评定简单方便了。

　　当输入量间相关时，要考虑相关系数。在进行本例中的样品复溶体积(V_Res)的标准不确定度评定时，由于皮重mt与毛重mg是用同一台天平测量的，因此它们间是相关的，相关系数r为-1。同样在评定加样体积(V)的标准不确定度时，由于V₁与V₂间是相关的，在进行方差合成时计算了两者的协方差。
    本文中所描述的评估模式是基于本实验室ALT测定程序及仪器状况的，其他实验室在进行此类评估时，应先根据具体实验程序及硬件等情况确定数学模型与不确定度来源后再进行评定。